（2/2）同一位作者的两篇宫颈癌单细胞文章

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（2/2）同一位作者的两篇宫颈癌单细胞文章 by 今天看文献了吗

文章标题："Single-cell dissection of cellular and molecular features

underlying human cervical squamous cell carcinoma initiation and progression"

发表杂志：Science advances

影响因子：14.957

这是一篇关于宫颈鳞癌（CESC）的单细胞研究，虽然为同一作者，但和上一篇研究有着不同的思路。先来读一下作者的摘要吧：

摘要提供了3点信息：

1.收集了13例处于不同恶性肿瘤阶段的人类宫颈组织样本进行测序；2.发现一些亚型丰度和CESC进展显著相关；3.CESC中NRG1-ERBB3通路和基质CAFs致癌相关。

根据以上信息已经可以大致推断作者的分析思路：首先降维聚类，根据正常上皮到肿瘤的发生不同阶段分组，使用类似monocle的方法在特定细胞亚群根据肿瘤发生阶段构建进化轨迹，观察从正常上皮到肿瘤发生这一过程中特定细胞亚群的特征变化。然后使用反卷积的算法结合TCGA带生存数据的样本进行预后分析，最后通过正常组织和肿瘤组织中的某一特定亚群之间的差异基因筛选出潜在的通路，并加入基础实验验证通路的改变影响特定亚群的致癌功能。

13例样本包括：3例正常宫颈上皮、2例宫颈上皮内瘤变（CIN）、3例早期CESC、5例晚期CESC

Figure1 13例宫颈组织单细胞数据概览

A：作者的单细胞工作流程图，首先通过荧光分选去除死细胞（7-AAD-），然后流式分选免疫细胞（CD45+）、上皮细胞（CD45−EpCAM+）、内皮细胞（CD45−CD31+）以及成纤维细胞（CD45−EpCAM−CD31−）

B-D：分别根据细胞类型、致瘤阶段以及样本编号绘制的tSNE降维图。作者把细胞分为6个大类：髓系、B细胞、NK/T细胞、内皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞，marker基因如下：

NK/T：CD2；CD3DB：CD79A；MZB1myeloid：ITGAX；CSF1Repi：EPCAM；KRT5fibro：PDGFRA；RGS5endo：CDH5；KDR

E：亚群中marker基因表达

F：不同样本中6种细胞占比

G：不同致瘤阶段6种细胞占比

Figure2 上皮细胞在CESC发生过程中的演变

A：首先是检测了一些标记基因在4个阶段的表达：

KRT14，正常宫颈上皮标记，在NC和CIN中高表达，肿瘤低表达KRT17，鳞癌标志物；CDKN2A、MKI67、TOP2A，增殖标志基因，在肿瘤中

B-C：4个疾病阶段之间的差异基因和差异转录因子表达

D-F：monocle分析揭示上皮细胞的进化轨迹，作者是以上皮细胞的分群结果进行分析，这里如果是以疾病阶段作为区分更合理，能直接看到不同疾病阶段上皮细胞所处的位置，这里可能是作者分析后发现不够直观或无法很好地解释，但是解释得十分别扭。

总而言之，作者发现，上皮细胞分为了两个进化轨迹，处于轨迹起始端的细胞（左边），具有TP63+KRT5+的特征，根据文献报道可能是发展为CESC的原始细胞谱系，一部分处于轨迹末端的细胞，具有恶性标志物高表达的特征，即上皮向恶性发展的方向（右下），另一部分高表达上皮分化特征的细胞，表示了上皮正常分化的方向（右上）。细胞周期分析也表明，恶性分化的细胞处于更活跃的复制分裂状态。

G-H：分析拟时序相关的差异基因和转录因子，大致分为两种：pattern1属于正常上皮高表达，随着肿瘤发生表达降低，pattern2-5属于上皮低表达，随着肿瘤发生逐渐上调

Figure3 上皮细胞的亚群分析

A：对上皮细胞进一步分群为8个亚群

B：不同疾病阶段的上皮细胞分布，其实大致可以看出来，NC和CIN部分重叠，肿瘤阶段细胞几乎重叠，也表明了一定的演变方向

C：8个上皮亚群中的特征基因表达

D：不同疾病阶段中8个亚群占比的差异

E：GSVA分析研究相关通路在8个亚群中的富集

F：由于1、3、7、8亚群是正常或肿瘤组织的代表性亚群，作者又对这几个亚群的免疫抑制基因IDO1以及HLA、IFIT（干扰素）、CXCL9-11（趋化因子）相关基因的表达差异进行分析，这些基因在8亚群中高表达

G：CXCL9-11与T细胞表达的一些相关受体配对

H：不同T细胞亚群中这些受体的表达（这里提前展示了T细胞分群的结果，作者后面进一步对T细胞分群时提到）

作者这一块逻辑有些拧巴，Figure2跟Figure3对调比较好，Figure2展示了Figure3才做的上皮分群，Figure3又展示了后面T细胞的分群结果...

I：多色荧光展示IOD1标记的上皮8和CD3标记的T细胞的关系，作者的意思大概是8亚群的丰度增加能够促使T细胞浸润，但是图片也没有对比，实在看不出来表达的意思

Figure4 CESC进展过程中的髓系细胞

A：作者对髓系继续分群，分为8个亚群

B：特征基因表达

C-D：8个髓系亚群中差异基因和转录因子的表达

E：不同疾病阶段的亚群差异

F：根据特征基因集通过反卷积算法推断TCGA样本中的亚群丰度，并计算特定亚群丰度和患者生存预后的关系

G：检测髓系细胞中M2和M1 signature的差异（推算每个细胞中对应的基因集富集分数并均一化展示）

H-I：8个亚群中已知可共同调节APOE+巨噬细胞和CCL20+巨噬细胞表达基因的分子的表达，发现PRDM1、PPARG、RREB1共同表达上调，并且与不良预后相关(好像还有几个表达上调的基因吧，作者文章里没有体现）

Figure5 CESC进展过程中的NK/T细胞

A-B：对NK/T细胞降维分析，共鉴别出了2个NK细胞亚群和9个T细胞亚群，如下

NK细胞：CD16+NK细胞（FCGR3A+）；CD56+NK细胞（NCAM1+)CD4+T细胞：幼稚CD4 T细胞（CCR7+）；辅助T细胞17 Th17（IL17A+)；TNFRSF9 high Treg细胞(TNFRSF9 high)；TNFRSF9 low Treg细胞(TNFRSF9 low)；CD8+T细胞：幼稚CD8 T细胞（CCR7+）；ZNF683+ CD8+ T细胞(ZNF683+)；GZMK+ CD8+ T细胞(GZMK+)；耗竭T细胞(LAG3+)以及增殖中T细胞亚群 (MKI67+)

C：亚群筛选出的差异基因热图

D：不同CESC阶段的一些NK/T细胞亚群占比变化

E：反卷积算法推算TCGA的bulk RNA-seq数据中NK细胞浸润程度并做生存分析

F-G：对两个NK细胞作差异分析筛选差异基因并进行GO分析，发现一些细胞毒性相关基因在CD16+ NK细胞中高表达，并且介导细胞毒性的GO途径在CD16+ NK细胞上调基因中富集

H：拟时序分析发现TNFRSF9 high Treg细胞和Th17细胞处于幼稚CD4+T细胞分化的两个不同方向

I：已被证实参与CESC进展的CCL20在上述两个亚群中特征性表达，如D图所示，以上两个亚群也在CESC进展过程中（相比于NC和CIN）比例增加

J：CCL20的生存分析

Figure6 CESC进展过程中的内皮细胞

A-C：作者将内皮细胞（EC）分为3个亚群，如下所示：

PODXL+ EC(PODXL+, INSR+)MHC high EC(HLA-DPA1+, SELP+)GJA4+ EC(GJA4+, CXCL12)

D-E：EC亚群之间的差异基因和差异转录因子

F：CESC进展过程中EC亚群比例变化

G：亚群相关的生存分析

H：差异基因的GO分析（和另外两个亚群相比）

Figure7 CESC进展过程中的成纤维细胞

A-C：

将成纤维细胞分群，作者将成纤维细胞分成6个亚群：

正常成纤维细胞Fib1、Fib2，主要由NC组构成；

基质成纤维细胞mCAF，高表达细胞外基质特征基因PDGFRA、LUM、DCN；

以及3个血管成纤维细胞（vCAF）亚群，高表达MCAM（CD146）、RGS5、MYH11

D：多重免疫荧光标记PDGFRA和MCAM表征mCAF和vCAF在CESC中的定位

E：各个亚群的特征基因表达热图

F：作者选取了Wnt、EMT、缺氧这三个促癌表型，通过GSEA研究他们在mCAF和vCAF之间的富集情况，结果显示均在mCAF中富集

G：各个亚群间的差异基因分析，标红的基因为 “genes associated with cancer stemness and/or progression or metastasis-associated TFs”，和肿瘤干性和/或进展转移相关TFS 相关的基因

H：反卷积算法推算TCGA CESC样本的mCAF，并进行生存分析，结果显示高mCAF浸润的患者生存较差

I：将以上各种注释出来的细胞簇进行多因素Cox回归，展示和患者生存相关的细胞亚群

Figure8 mCAF通过NRG1 / ERBB3途径促进CESC进展

作者接下来使用CellPhoneDB进行细胞间通讯分析以进一步挖掘mCAF作用于肿瘤微环境的分子机制

首先作者对不同疾病阶段的CAF（以及NC中的成纤维细胞）亚群进行受体-配体对分析（A），发现NRG1和WNT5A两个配体在mCAF的表达水平高于NC的正常基质成纤维细胞，于是在图B中展示亚群细胞和肿瘤细胞中相对应的受体-配体对表达（COL1A1为CAF标记，PDGFRA为mCAF标记），可以看到肿瘤细胞中相对应的受体ERBB3和FZD6均有表达

这里感觉图B应该和图A一样，按疾病阶段的CAF亚群分组展示会不会更好？

C：免疫荧光染色证实上述发现：（引用一下作者原文）"These transcriptional data were mirrored by immunolabeling of CESC sections, confirming that mCAFs mainly expressed neuregulin 1 (NRG1) and wnt family member 5A (WNT5A), while tumor cells correspondingly expressed high levels of the receptors including ERBB3 and FZD6"

翻译一下就是，我们在CESC切片中通过免疫荧光证实了mCAF主要表达NRG1和WNT5A，肿瘤细胞主要表达ERBB3和FZD6。

这里还是有一些小问题：作者的研究是在默认不同切片组织分布完全一致的情况下进行的，这会带来一定概率的误差。首先图像比较模糊看得不是很清楚，作者使用的应该是同一样本的连续切片，但是可以发现不同组之间组织形态还是存在一定差别的；其次作者用了这几个指标对细胞进行标记：α-SMA标记总CAF，PDGFRa标记mCAF，E-cad标记上皮细胞，然后对NRG1和WNT5A、ERBB3和FZD6的表达定位进行研究，但是对四个指标的定位时只表征了肿瘤细胞（E-cad），这只能说明NRG1和WNT5A在肿瘤细胞外的细胞中表达，ERBB3和FZD6在肿瘤细胞中表达。

接着作者进一步验证细胞通讯分析的结果，通过流式筛选PDGFRA+的mCAF细胞

D：与肿瘤细胞共培养发现mCAF的加入显著促进了细胞迁移和肿瘤成球

E：mCAF的共培养降低了卡铂（CBP）和顺铂（DDP）两种抗肿瘤药物对肿瘤成球的抑制作用

F：沉默mCAF中的NRG1显著抑制了其促进肿瘤成球和细胞迁移的能力

G：外源性NRG1的添加显著促进了肿瘤成球和细胞迁移

H：外源性NRG1的添加增强了肿瘤耐药性

总结：本文整体思路和上一篇比较接近，作者采用的分组是不同时期的CESC组织，同样对多个亚群进行分组分析，研究比例变化、功能通路富集等，此外，作者基于通路富集进行了一定扩展，并且加入了反卷积的生存分析、拟时序分析等丰富了文章的逻辑。最后基于细胞配体受体对分析补充了一部分实验，虽然实验设计并不是特别深入，但是对于单细胞分析来说是一个事半功倍的加分点，也是我们模仿/补实验的一个非常好的学习案例。